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A estória é uma prequela para o jogo Assassin's Creed II. É centrado em Giovanni Auditore, o pai do personagem principal do jogo, Ezio Auditore da Firenze.
Giovanni é uma Assassino que vive na Itália do século XV, durante a Renascença. No começo dessa nova era, a conspiração está sendo traçada por uma família corrupta para derrubar a poderosa família Medici e destruir uma Itália unificada. Como uma Assassino, Giovanni tem de enfrentar essa ameaça e levar os culpados à justiça. A estória introduz a situação antes de Assassin's Creed II, e os inimigos de Giovanni e Ezio.